Payame Noor University, Iran Iranian Journal of Analytical Chemistry 2383-2207 12 2 2025 09 21 β-Sitosterol from Allium cepa Seeds Exerts Dual-Target Anticancer Activity Against NFKB1 and STAT3 in Triple-Negative Breast Cancer: An Integrated In Silico and In Vitro Investigation بتا-سیتوسترول استخراج‌شده از دانه‌های پیاز (Allium cepa) از طریق مهار همزمان NFKB1 و STAT3 با اثر ضد سرطانی دو محوره در سرطان پستان سه‌گانه منفی(TNBC): بررسی یکپارچه سلیکو و آزمایشگاهی 12 28 12967 10.30473/ijac.2026.77606.1345 EN Sholeh Javadi Department of Biology, Payame Noor University, Tehran, Iran. Somayeh Farahmand Department of Biology, Payame Noor University, Tehran, Iran. Helia Bayat Department of Biology, Payame Noor University, Tehran, Iran. Reza HajiHosseini Department of Biology, Payame Noor University, Tehran, Iran. Sima Nasri Department of Biology, Payame Noor University, Tehran, Iran. Journal Article 2025 09 15 Triple-negative breast cancer (TNBC) lacks targetable receptors, rendering conventional chemotherapy the sole standard of care despite its associated toxicity and acquired resistance. The constitutively activated NF-κB and STAT3 signaling axes represent mechanistically interdependent oncogenic drivers in TNBC, making their simultaneous inhibition a compelling therapeutic strategy. β-Sitosterol, the predominant phytosterol of <em>Allium cepa</em> seeds, has demonstrated broad antiproliferative properties; however, its capacity for dual-target engagement against NFKB1 and STAT3 has not been systematically characterized. GC–MS profiling of <em>A. cepa</em> seed oil identified β-sitosterol as the principal constituent (80.45%). Computational ADMET analysis, Human Protein Atlas-based immunocytochemical target validation, and Auto Dock Vina molecular docking against NFKB1 (PDB: 5AX3) and STAT3 (PDB: 7LET) were performed. Anticancer activity was evaluated in MDA-MB-231 cells via MTT assay, with apoptotic mechanism characterized by Annexin V-FITC/PI flow cytometry. β-Sitosterol demonstrated favorable drug-likeness with predicted mitochondrial localization and absence of mutagenicity. Docking yielded binding energies of −7.0 and −6.7 kcal/mol for STAT3 and NFKB1, respectively, driven by hydrophobic interactions. MTT assay revealed concentration-dependent cytotoxicity (IC₅₀ = 39.56 µM; 72 h; F = 113.8, p < 0.0001). Flow cytometry confirmed significant induction of early (30.7 ± 2.5%) and late apoptosis (20.3 ± 4.4%) versus negligible baseline levels in controls. β-Sitosterol exhibits dual computational binding affinity for NFKB1 and STAT3 alongside potent pro-apoptotic activity in TNBC cells, establishing a mechanistic foundation for its further translational development. سرطان پستان سه‌گانه منفی (TNBC) فاقد گیرنده‌های قابل هدف درمانی است و شیمی‌درمانی متداول، علی‌رغم سمیت بالا و مقاومت اکتسابی، تنها گزینه استاندارد درمانی محسوب می‌شود. محورهای سیگنالینگ NF-κB و STAT3 در TNBC به‌طور مداوم فعال هستند و به‌عنوان محرک‌های انکوژنیک متقابل شناخته می‌شوند. ازاین‌رو، مهار همزمان آن‌ها یک راهبرد درمانی جذاب محسوب می‌گردد. بتا-سیتوسترول، فیتوسترول غالب دانه‌های <em>Allium cepa</em>، خواص ضدتکثیری گسترده‌ای نشان می‌دهد؛ با این حال، توانایی آن در تعامل همزمان با NFKB1 و STAT3 به‌صورت سیستماتیک بررسی نشده است. پروفایل‌سازی GC–MS روغن دانه <em>A. </em>cepa، بتا-سیتوسترول را به‌عنوان ترکیب اصلی با سهم ۸۰٪ شناسایی کرده است. آنالیز محاسباتی ADMET، اعتبارسنجی ایمونوسیتوشیمیایی اهداف از پایگاه داده Human Protein Atlas، و داکینگ مولکولی با AutoDock Vina علیه NFKB1 (PDB: 5AX3) و STAT3 (PDB: 7LET) انجام گرفت. فعالیت ضدسرطانی در سلول‌های MDA-MB-231 از طریق سنجش MTT ارزیابی شد و مکانیسم آپوپتوز با فلوسیتومتری Annexin V-FITC/PI مشخص گردید. بتا-سیتوسترول دارای پروفایل دارویی مطلوب، توزیع پیش‌بینی‌شده در میتوکندری، و فقدان جهش‌زایی ژنوتوکسیک گزارش شد. داکینگ انرژی‌های اتصال 7.0- و 6.7- کیلوکالری بر مول را به‌ترتیب برای STAT3 و NFKB1 نشان داد که عمدتاً از طریق برهمکنش‌های هیدروفوبیک ایجاد می‌شوند. سنجش MTT سمیت سلولی وابسته به غلظت را آشکار کرد (IC₅₀ = 39.56 µM؛ 72h؛ F = 113.8، p < 0.0001). فلوسیتومتری القای معنادار آپوپتوز اولیه (30.7 ± 2.5%)  و آپوپتوز دیررس (20.3 ± 4.4%) را در مقایسه با سطوح پایه ناچیز در گروه کنترل تأیید کرد. بتا-سیتوسترول همراه با قدرت اتصال محاسباتی دوگانه به NFKB1 و STAT3، فعالیت آپوپتوزی قوی در سلول‌های TNBC از خود نشان می‌دهد و بدین‌ترتیب پایه مکانیستی برای توسعه ترجمانی بیشتر آن به‌عنوان داوطلب درمانی دو محوره در سرطان پستان سه‌گانه منفی فراهم می‌آورد. https://ijac.journals.pnu.ac.ir/article_12967_3e769123f0a6332941b1eb2c7ad277ca.pdf